О регуляторных механизмах изменений формы эритроцитов человека. Часть 1.

А.Н. Метелкин

Аннотация

Собраны материалы работ, выполненных сотрудником ВНИИ оптико-физических измерений в области голографической микроинтерферометрии, телевизионной микроскопии и лазерной нефелометрии эритроцитов. Работы выполнены на клинической базе Второго МОЛГМИ им Н.И.Пирогова, в ДКБ № 1 (Морозовская больница). По результатам исследований предложена модель развития эритроцитов от молодой клетки, ретикулоцита, до утилизации старых клеток в селезенке. Показана связь между изменением формы клетки, вызванной фрагментацией мембраны эритроцита и переходом от диска к сфере. Сферулизация, как маркер ослабления клетки и сигнал для ее утилизации. Показана независимость перехода от диска к сфере от природы действующих факторов. Это позволяет предположить наличие единого механизма утилизации ослабленных клеток, вне зависимости от природы нарушений. В отраженном лазерном свете, впервые были зафиксированы колебания поверхности эритроцитов, что может пролить свет на реологические свойства клеток. Из наблюдений за поведением эритроцитов in vitro предложена гипотеза о трансформации эритроцита в малый лимфоцит.

Оглавление

1. Глава 1. Записки голографического биофизика
2. Глава 2. Методы. Голографическая микроинтерферометрия, телевизионная микроскопия и лазерная нефелометрия живых эритроцитов человека
3. Глава 3. Механизмы изменения параметров эритроцитов в процессе жизнедеятельности.
4. Глава 4. Гипотеза о трансформации эритроцита в малый лимфоцит

Приложение 1. А.Н. Метелкин Динамические характеристики живых эритроцитов . Тезисы доклада. Юбилейная сессия Российской академии естественных наук «ЛЕОНАРДО ДА ВИНЧИ ХХ ВЕКА». Москва, 1997г.

Глава 1. Записки голографического биофизика

Мои благодарности

Данная работа – совместный труд коллектива ученых, врачей инженеров и физиков, которые принимали активное участие в обсуждении результатов, предлагали пути решения. Совместные публикации показывают широкий круг специалистов, вовлеченных в тему.

Я благодарен директору нашего института, ВНИИ оптико-физических измерений, профессору Борису Михайловичу Степанову, за то, что предоставил абсолютную свободу для творчества, всегда помогал в трудные периоды, поддерживал и ободрял. Он подписывал все мои письма до уровня министерств, и наша небольшая группа была обеспечена самым современным по тем временам оборудованием. Заведующая голографической лабораторией Вера Моисеевна Гинзбург, впоследствии «бабушка советской голографии», так же оказывала помощь и поддержку, принимала живейшее участие в обсуждении результатов.

Огромная благодарность и признательность ученым из Института Атомной Энергии им. Курчатова, А. Петрову и Н. Бонч-Осмоловскому. Они сами предложили мне свою помощь и провели ряд уникальных исследований по расшифровке фазовых функций эритроцитов.

Отдельная благодарность Станиславу Филипповичу Чалкину, сотруднику филиала Института Атомной Энергии в Троицке. Он постоянно курировал весь процесс внедрения в практику лазерных технологий, обеспечил финансирование ряда проектов.

Медицинская и научная часть работ была обеспечена и поддержана врачами и научными сотрудниками Второго МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова (ныне РНИМУ им. Н.И. Пирогова) и специалистами Морозовской больницы. Огромная признательность за дружескую поддержку выражаю Александру Гавриловичу Талалаеву. В то время он возглавлял морг Морозовской больницы, чьи подвалы и приняли нашу группу и большую массу технического оборудования. Наши беседы и встречи всегда были заряжены позитивом и положительной энергией. Это значительно облегчало трудности работы на стыке физики и медицины. Кафедра факультетской педиатрии, ее руководитель, гематолог, профессор, Наталья Сергеевна Кисляк, старший научный сотрудник кафедры Александр Григорьевич Румянцев, их неоценимые советы и рекомендации позволили определить главные направления работ в области гематологии.

Выражаю благодарность и директору Московского научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РСФСР, профессору, д.м.н. Юрию Евгеньевичу Вельтищеву. Он активно поддержал исследования и направил своего аспиранта, который подтвердил своими результатами важность диагностического признака разделения эритроцитов на отдельные группы. Результаты были получены методом лазерной нефелометрии.

Это далеко не полный список, тех. Кто помогал в работе. В те времена атмосфера дружеского участия и заинтересованности были главными факторами поддержки в работе.

История вопроса

Часть 1. ВНИИОФИ.

Целью книги является публикация материалов, которые не нашли отражения в научной периодике по различным причинам: сначала шла работа по поиску методов и средств диагностики, потом шло накопление результатов, а потом СССР развалился и работы были остановлены.

Так вышло, что после биофака МГУ, с кафедры биофизики я, каким-то неведомым мне чудом, оказался во ВНИИ оптико-физических измерений. Это был научный институт чисто технический, который имел по тем временам хорошее финансирование, имелась современная измерительная аппаратура, деловые контакты с ведущими физическими институтами – ФИАН, ИАЭ, МИФИ, ГОИ ЛОМО и ЛИТМО. Тем не менее в институте не было биологии никакой, а были гелий-неоновые лазеры ЛГ-38 и была голографическая лаборатория под руководством д.т.н. Веры Моисеевны Гинзбург. В то время она курила Беломор, она прошла фронт и участвовала в качестве радистки в Сталинградской битве. Позже, она нам рассказала, что от битвы у нее в памяти сохранились только два воспоминания: непрерывный грохот разрывов снарядов и бомб не давал заснуть, и, пыль от битого красного кирпича, которая проникала везде и нечем было дышать.

Когда мне оформили документы, и я был принят на работу на должность инженера с окладом 110 рублей плюс премия, я начал задавать вопросы, а кто мне будет ставить задачи, кто мой руководитель? Вера Моисеева мне радостно заявила, что я, как биофизик, буду в голографической лаборатории заниматься внедрением голографии в биологию: био и физик…А как это? На этот вопрос мне никто не ответил и жизнь понеслась, меня зачислили в группу, вся лаборатория была поделена на группы. Мой начальник, мало чем мог мне помочь, и я несколько лет учился голографии, мистической области физики, которая давала объемные изображения людей, всего чего угодно.

Тот период был крайне болезненный, поскольку я хорошо понимал, что я голографию в биологию никак не внедрю, если сам, именно сам, без какой-либо поддержки не найду выход. Обстановка в лаборатории была вполне демократической: кто хотел бездельничать, тот бездельничал, мог работать через пень колоду, кто хотел и мог работать, двигать науку, тот был полностью поглощен свой работой и получал реальные результаты. Наш институт занимался не только голографией, но и фотоникой, наукой о сверхскоростной фотографии, физики работали в области сверхнизких световых сигналов и ловили отдельные кванты света.

Первый успех заключался в том, что основным методом количественной оценки физических объектов, практически любых, прозрачных и непрозрачных, была голографическая интерферометрия, если добавить к этой науке микроскоп и мы погружаемся в мир фазовых, прозрачных объектов. Когда я собрал первый свой голографический интерференционный микроскоп с увеличением объектива Х 40, то начал судорожно искать фазовые прозрачные объекты. Пошел на биофак на кафедру физиологии животных и был там награжден лягушачьей икрой и гидрами. Первые интерферограммы меня воодушевили. На фотографиях были видны четкие интерференционные полосы, которые позволяли видеть в прозрачном объекте внутреннюю структуру. Примерно в это время у меня появились первые доклады на научных конференциях.

Следующим шагом было найти из множества биологических объектов, тот который бы был наиболее информативным и давал именно реальную пользу для биологии и медицины. Я уже освоился с лабораторией завел дружбу с наиболее сильными специалистами по голографической интерферометрии макрообъектов. И засел за книги в Ленинке, в отделе «биология». И тут я открыл для себя книгу Чижевского про эритроциты и их микроскопические наблюдения. Эти работы так меня потрясли своей простотой и доступностью изложения, что я «заболел» эритроцитом и под него стал собирать голографический интерференционный микроскоп. Это было моё твердое решение: продолжить работы по изучению живых эритроцитов без их обработки in vitro и попробовать из этих данных получить картину поведения эритроцитов in vivo .. то есть описать поведение эритроцитов в русле крови от их зарождения до их утилизации. Мне это удалось и базовые результаты были опубликованы много позднее в трудах конференции МГУ, посвященной Чижевскому. Название конференции: «Чижевский, Леонардо 20го века».. (Приложение 1).

Часть 2. Морозовская больница, Второй МОЛГМИ и все, все, все.

Руководство института дало добро на создание небольшой научной группы в медицинском учреждении для проверки моих замыслов. Этим учреждением оказалась именно Морозовская больница. Я, уже младший научный сотрудник, попал на прием к главврачу больницы в поисках места, где можно было разместить голографические стенды для научных исследований. Главврач мне посоветовал обратиться в патологоанатомическое отделение, которое сравнительно недавно въехало в новое, недавно построенное здание, где были полуподвалы совершено пустые. Так я попал в морг Морозовской больницы и познакомился с удивительным коллективом детских патологоанатомов.

Мое знакомство с Александром Гавриловичем Талалаевым произошло так: я зашел в здание морга, окрыленный идеей организации научной лаборатории, я летел на крыльях, спросил у старшей сестры, где начальник, она мне ответила, что он в 17 комнате. Я начал на дверях читать номера комнат, дошел до 17ой открыл… и тихо охнув, пискнув «извините», как-то боком вышел, выполз, мне стало дурно. Впоследствии Александр Гаврилович долго смеялся надо мной, и меня успокоил, один человек японского происхождения просто описался, когда неожиданно заглянул… в прозекторскую. (специальная комната для вскрытия в морге).

По мере развития темы у меня появилось масса научных контактов не только во Втором МОЛГМИ (Морозовская больница была клинической базой этого института), меня познакомили с Юрием Евгеньевичем Вельтищевым, директором Московского научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РСФСР, в то время остро встала проблема ожирения у детей и мне пришлось исследовать жировые клетки крыс, было выполнено исследование эритроцитов кровы у детей с патологией почек. Наиболее важные научные результаты были получены после моих контактов с педиатрами гематологами. Тогда Александр Григорьевич Румянцев был старшим научным сотрудником, и мы с ним плотно контактировали по при обсуждении результатов работ. Кафедра факультетской педиатрии, ее руководитель, профессор Наталья Сергеевна Кисляк проводила регулярные научные семинары, и я на них часто присутствовал и делал короткие доклады по результатам работ.

Часть 3. In vitro. Фазовые объекты, это просто.

Немного физической оптики клеток крови. Дело в том, что у светового микроскопа есть два недостатка: обычный оптический микроскоп видит тени клеток крови, если их рассматривать в капле физраствора. Клетки тканей практически прозрачны для видимого света. Второе ограничение, критерий Релея, это ограничение в разрешении микроскопа. То есть мелкие детали, меньше чем 0,2 мкм в микроскоп разглядеть нельзя. Для того, чтобы эритроцит рассмотреть его нужно покрасить краской и высушить. При этом его размеры изменяются, исключаются наблюдения за живой клеткой. Так, во всех учебниках по гематологии диаметр эритроцита считается 7,4-7.6 мкм , в капле физраствора его размеры 8,2 – 8,4 мкм и это его истинные размеры.

С точки зрения физической оптики крови, эритроцит, это прозрачный объект, такие объекты называют фазовыми. Дело в том, что человеческий глаз, наш оптический элемент, так устроен, что они чувствует интенсивность света в огромном диапазоне и у него есть чувствительные элементы, которые различают цвет. Фазу глаз не видит. Не дано. А фазовые объекты оптики научились видеть с помощью интерференции, когда на фоне прозрачного объекта появляются интерференционные полосы связанные с возмущением фазы проходящего через объект света. Для понимания дальнейших рассуждений этого достаточно.

In vitro, это такой род исследований при котором клетки изымаются из организма, определенным образом обрабатываются, измеряются и делается анализ крови на предмет диагностики какого либо заболевания или для научных исследований свойств этих клеток. Применяется окраска цветными и флуоресцентными красителями, в последнем случае клетки можно изучать в капле и смотреть за динамикой процесса. В ходе научных исследований постепенно накапливается материал, который позволяет перенести данные о клетках изученных in vitro на состояние этих клеток внутри организма то есть in vivo..

Не вдаваясь в аппаратурные особенности устройства голографического интерференционного микроскопа, который был собран по схеме Маха-Цендера, скажу только, что для его работы пришлось изготовить специальный голографический стенд с антивибрационной плитой весом в полторы тонны. Плита была подвешена на огромных толстых стойках. В качестве антивибрационной развязки использовалась воздушная подушка из толстой резины. На этой плите и собиралась оптическая схема. В схеме использовался обычный оптический микроскоп, который был встроен в интерферометр. Были применены максимальные увеличения: объектив х100 и окуляр х20 то есть было общее увеличение в 2000 крат.

Глава 2. Методы. Голографическая микроинтерферометрия, телевизионная микроскопия и лазерная нефелометрия живых эритроцитов человека

Все основные результаты изложены в диссертации: А.Н. Метелкин «Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов». В данной публикации мы рассмотрим методики измерения и количественные характеристики эритроцитов.

Нашей группе были созданы благоприятные условия работы: хорошее финансирование, закупалась современная измерительная аппаратура, налажены деловые контакты с ведущими физическими институтами – ФИАН, ИАЭ, МИФИ, ГОИ ЛОМО и ЛИТМО. Была предоставлена относительная свобода в выборе тематик. ВНИИОФИ институт-разработчик измерительной аппаратуры имел экспериментальную базу для разработки приборов, построенную по принципу детского конструктора с набором унифицированных элементов и комплектующих для удобства макетирования: стенды с набором оптико-механических узлов для прецизионного крепления и юстировки элементов схемы, лазеры, как источники излучения, фотодетекторы: ФЭУ, ФД, сканеры и телекамеры, современная аналоговая аппаратура и вычислительная техника. Все это позволяло добиваться оптимальных результатов в короткие сроки. Были разработаны и испытаны в условиях клиники: голографический интерференционный микроскоп, лазерный телевизионный микроскоп с видеозаписью в проходящем и отраженном свете, лазерный нефелометр

Часть 1. Голографический интерференционный микроскоп.

Рис. 1 Серийный образец микроскопа голографического интерференционного.

Голографический микроскоп по типу двухлучевого интерферомета Маха-Цендера был разработан в нескольких вариантах, последний предполагал ввод информации в ПК.

Рис. 2. Принципиальная схема голографического интерференционного микроскопа и средства визуализации и обработки интерферограммы: Л1 и Л2 – линзы коллиматора, РЩ – регулируемая щель и СУ-система усреднения когерентных шумов, Д – светоделитель, З-1, З-2, З-3 – поворотные зеркала, К-1 и К-2 – кондесоры, Об.-1 и Об.-2 – микрообъективы. Интерференционная картина передается с помощью телекамеры на монитор и вводится в ЭВМ для последующей обработки.

Рис. 3 Интерферограммы двух форм эритроцитов: дискоцита и сфероцита.

Рис. 4. Параметры формы профиля эритроцита, нормоцита.

Рис. 5. Фазовая функция отражающая наличие микровыростов на поверхности эритроцита: предгемолитическая фаза. Материалы получены совместно с учеными ИАЭ им. Курчатова.

Методика измерения.

Исследовалась венозная гепаринизированная кровь доноров, консервированная кровь и кровь больных с различными нозологиями (обменного характера сахарный диабет, пневмония, и с наследственными нарушениями мембраны -наследственный микросфероцитоз) при различных состояниях больных: в разгар заболевания, в условиях реанимации и в процессе выздоровления. Кровь для микроскопирования бралась на гепарине и разводилась изотоническим раствором NaCl. Исследования проводились не позднее, чем через 1 час после забора крови. Применялось максимальное для световой микроскопии увеличение: Об. х90, Ок. х25.

Данные о параметрах клетки статистически обрабатывались и сопоставлялись между собой (Таблица 1).

Таблица 1 Сравнительные характеристики в норме и при наследственном микросфероцитозе:

НОРМА Н. СФЕРОЦИТОЗ

1.Диаметр D -(МКМ) 8,2 7,4

2.Толщина(МКМ):

максимальная H 2,6 3,5

минимальная h 0,9 1,9

3.Параметры формы:

Кфи 0,2 03,2

Кэл. 0,99 1,28

2

4.Площадь поверхности S (МКМ ) 122 99

3

6.Объем V (МКМ ) 74 73

7.Коэффициент сферичности:

K = S/V 1,65 1,22

7.Сухая масса m (ПГ) 31_ 1 29_1

8.Концентрация C Hb (%) 36,6_1,5 38,5

C = m/V x 100%

Достоверных различий во всех параметрах между нормой, пневмонией и сахарным диабетом при различных степенях тяжести заболеваний не отмечено.

Часть 2. Телевизионный микроскоп в проходящем и отраженном свете.

Микроскопия в проходящем лазерном и обычном свете

Рис. 6. Макет телевизионного оптического микроскопа с выводом на монитор и видеомагнитофон. Хорошо видны различные формы эритроцитов в предгемолитической фазе: сфероциты с шипиками.

Рис. 7. Микрофотография брыжейки крысы снятая в остром опыте.

Микроскопия в отраженном лазерном свете.

Рис. 8. Интерференционная картина от двух стенок верхней и нижней, полученная в отраженном лазерном свете.

Был использован серийный микроскоп МБИ-15 с гелий-неоновым лазером в качестве источника освещения.

Наблюдались колебания интерферограмм эритроцитов.

Рис. 9. Последовательная фотосъемка одной клетки с интервалом 1 сек. Видны различия форм интерферограмм.

Часть 3. Лазерная нефелометрия эритроцитов.

Описание нефелометра

       Лабораторный образец лазерного нефелометра был собран на основе He-Ne лазера мощностью 1 мвт  (Рис. 1). При создании прибора были выполнены предварительные исследования индикатрис рассеяния, выполнен расчёт однократности рассеяния от взвеси эритроцитов в изотоническом растворе NaCl. Одновременно проводились исследования живых эритроцитов методами голографической миктоинтерферометрии и лазерной микроскопии . Результаты  исследований били использованы для интерпретации данных по лазерной нефелометрии .
       Для измерения светорассеяния взвесь  эритроцитов в  растворе NaCl с различной тоничностью  помещалась в цилиндрическую кювету с магнитной с мешалкой. В результате исследований выявилась гетерогенность популяции эритроцитов , которая коррелировала  со степенью тяжести заболевания in vivo и состоянием крови  in vitro.

Рис.10. Схема лазерного нефелометра для измерения интенсивности рассеянного лазерного света от суспензии эритроцитов. 

   Материалы

 В качестве объекта исследования бралась гепаринизированная кровь из локтевой вены в норме и при патологиях Обращалось внимание на то , чтобы время между забором крови и началом измерения не превышало  одного часа . На этапе отработки методики проводились исследования на крови животных – кроликов.

Методы

Описание методики:
     
    За основу была взята методика оценки осмотической резистентности эритроцитов при которой взвесь эритроцитов инкубировалась в течение часа в растворах NaCl с различной тоничностью: исходная концентрацией NaCl = 0,9 %   конечная – 0 %. Через час инкубации в пробирках происходил осмотический гемолиз эритроцитов, который регистрировался с помощью нефелометра. Фототок ФЭУ был пропорционален концентрации эритроцитов ( 6 ).
     Результаты анализировались в графическом виде . График осмотического гемолиза  эритроцитов выражает зависимость числа гемолизированных эритроцитов (в  %)  от осмотической силы раствора  (Конц. NaCl ) . При построении графиков обнаружено наличие   «горбов»  на S-образной кривой  которые интерпретировались нами как неоднородность популяции  эритроцитов и были измерены в количественном виде Рис. 2 .

 Рис. 11. График зависимости осмотической резистентности    эритроцитов от тоничности раствора NaCl. (На графике выделяются три групп клеток – слабые, средние и сильные.

Результаты. 

Тестирование метода выполнено на донорской крови: выявлено наличие трех групп эритроцитов

  1.Анализ донорской крови по группам: слабые, средние, сильные.

Исследовалась кровь взрослых доноров СПК КБ № 6 (17 чел.).
 
 Статистический анализ данных показал следующее:
1.  Наиболее вероятное число субпопуляций  – три . Среднее содержание эритроцитов по группам: слабые – 11%, средние – 39%, сильные – 50%.
2.   Границы  зон гемолиза   трех субпопуляций не зависят от крови донора и располагаются следующим образом: слабые клетки лизируются в зоне от 0,9% до 0,71% , средние – 0,71%-0,54%, сильные – 0,54% – 0% NaCl/

  2.Аутогемолиз донорской крови:

Донорская кровь инкубировалась при температуре  37 град. С в течение суток. Снимались показания о резистентности до и после инкубации.  На Рис.  3. показаны два графика до и через сутки аутогемолиза. Хорошо видно нарастание содержания слабых клеток.

Рис .3. Графики зависимости осмотической резистентности    эритроцитов от тоничности раствора NaCl: А – до аутогемолиза, Б – через сутки аутогемолиза. Слева вверху – процентное содержание групп клеток: сл. – слабые, ср. – средние, сн. – сильные субпопуляции клеток.

Глава 3. Свойства эритроцитов и их динамика в процессе жизнедеятельности.

Основные результаты исследования живых эритроцитов методами голографической микроинтерферометрии, телевизионной микроскопии и лазерной нефелометрии, сравнение с литературными данными привели к ряду открытий и обобщений, позволяющих пролить свет на неизвестные аспекты жизнедеятельности клеток, в результате чего возникает целостная картина жизни эритроцитов в кровеносном русле периферической крови. Можно выделить три основных момента:

1. Модель изменений формы эритроцита. Форма клетки, как определяющий фактор его функциональной активности в кровотоке. Описание динамики изменений молодой клетки в русле крови вплоть до процесса утилизации старого эритроцита в селезёнке путем его сферулизации.
2. Микроколебания мембраны эритроцита, ее значение для реологии.
3. Неоднородность популяции эритроцитов в норме и патологии и ее значение для диагностики состояния организма

Модель изменений формы эритроцита.

Для описания модели достаточно выделить ряд утверждений, описанные в литературе и придать им связность:

1. Эритроцит, безъядерная клетка, живущая за счет обмена с внешней средой, плазмой. У эритроцита нет репаративных, восстанавливающих мембрану механизмов. Любое повреждение мембраны смертельно для клетки, так же как для человека открытая рана.
2. Внутренняя часть мембраны выстлана сократительным белком, спектрином, в виде сети. Ячеистая структура мембраны позволяет блокировать все нарушения, любой природы за счет сжатия поврежденной ячейки мембраны спектрином. Образующийся микропузырёк с гемоглобином отрывается и выделяется в плазму. Независимость от природы повреждающего агента подтверждается литературными данными: обнаружена связь спектрина с наружным слоем гликопротеинов, (иммунные реакции), с гликолитическими ферментами и с K/Na активируемой АТФ-азой, (системы поддержания независимой внутренней среды клетки). Связь с гемоглобином (20 %) обеспечивает корреляцию между колебанием масс гемоглобина внутри клетки, а так же обеспечивает переход от диска к сфере.
3. Старение эритроцитов сопряжено с уменьшением диаметра клетки. Фрагментация мембраны – отщепление микропузырька в единичной зоне повреждения клетки (Чижевский отмечает 70-80 микровыростов на поверхности клетки) приводит к тому, что за жизненный цикл происходит в среднем 20-отщеплений микропузырьков что составляет 25-30% площади мембраны. При этом меняются геометрические параметры профиля клетки, изменяется объем и площадь поверхности, растет концентрация гемоглобина. Фрагментация мембраны носит приспособительный характер: при локальном повреждении мембраны происходит сжатие спектрина в ячейке сети с выбросом нарушенного участка клетки. Это приводит к уничтожению поврежденной зоны и к восстановлению целостности мембраны клетки. Ресурс этого механизма – 20 отщеплений, при этом происходит утолщение поперечного сечения клетки и облегчается сферуляция, переход от диска к сфере.
4. Известна реакция сферуляции, перехода in vitro дискоцита в сфероцит. Наблюдаемый в ходе исследований переход от диска к сфере имеет ту же сократительную природу: сокращение все спектриновой сети приводит к образованию шара меньшей площади, объём меняется мало. «Лишняя площадь» диска исчезает при ошаривании за счет образования микропузырьков. Наблюдались переходы при механическом надавливании объектива на покровное стекло препарата. Переход происходил за доли секунды. Эта реакция обратима если не происходит отрыв микропузырьков и, носит необратимый характер при их отщеплении. Физиологическое значение сферуляции, ошаривания: старые или нарушенные патологией эритроциты попадая в щели сосудистой стенки кровотока селезенки (селезенка, единственный орган, где нарушена целостность сосудистого русла) подвергаются негативному воздействию повреждающих факторов, ошариваются, и тем самым, теряют возможность вернуться в сосудистое русло и утилизируются.

Суммируя вышесказанное можно представить такую модель: эритроцит в норме и при патологии может находится в двух состояниях, в состоянии покоя в депо крови, при низких нагрузках на организм и, в рабочем состоянии, находясь в постоянном потоке, в сосудах различного диаметра. Форма эритроцита меняется в течение жизни за счет потери поврежденных частиц мембраны, выделяемой в виде микропузырьков во внешнюю среду. Итак, сферуляция, универсальный тест на жизнеспособность, который не зависит от природы поражения эритроцита. Этот тест работает в селезенке для отбора и утилизации старых и ослабленных эритроцитов по схеме: слабая клетка – ошаривание – задержка в строме селезенки – клеточное переваривание эритроцитов. Роль фильтра, задерживающего ошаренные клетки выполняют щели в селезенке при входе/выходе эритроцита из/в кровяное русло.

Что касается отщепленного вместе с мембраной гемоглобина, он составляет свободный гемоглобин плазмы, который можно измерить. Таким образом свободный гемоглобин может служить тестом на активность скорость повреждения мембран эритроцитов.

2. Микроколебания мембраны эритроцита, ее значение для диагностики состояния клетки, для реологии крови в целом.

В отраженном лазерном свете, в опытах in vitro, хорошо наблюдалась картина интерференции между нижней и верхней поверхностями клетки, наблюдались колебания интерференционной картины с частотой в доли герца. Интерференционная картина передавала дискоидальную природу клетки, линии интерференции носили концентрический характер.

Продолжение исследований в данном направлении может привести к ряду следующих открытий: измерение частоты колебаний в норме и патологии, анализ формы интерференционной картины может быть новым диагностическим тестом состояния эритроцитов, плазмы крови и организма человека. Интуитивно понятно, что наличие колебаний поверхности диска может быть синхронизировано с потоком в русле крови, может влиять на реологические свойства эритроцитов, в том числе и на РАСПРЕДЕЛЕНИЕ эритроцитов в потоке крупных сосудов.

Заключение

Материалы экспериментов показали решающую роль изменений формы эритроцитов, за счет отщепления микропузырьков от его поверхности, для его жизнедеятельности от выхода ретикулоцита в периферический отдел системы крови до утилизации старой или ослабленной клетки. Показано физиологическое значение перехода сфероцита в дискоцит для задержки старой клетки в строме селезенки с последующей его утилизацией. Обнаружено наличие групп клеток по признакам и осмотической резистентности, как свойство популяции эритроцитов в норме и патологии. Обнаружены микроколебания мембраны эритроцитов, что может служить как диагностическим признаком, и, вполне возможно позволить пролить свет на реологические свойства эритроцита, а так же, объяснить процессы обмена клети: колебание мембраны, как перемешивание плазмы на поверхности наружной мембраны эритроцита.

Глава 4. Гипотеза о трансформации эритроцита в малый лимфоцит

Речь идет о единичном опыте на крови здорового человека. Венозная кровь на гепарине разводилась физиологическим раствором до распада монетных столбиков и образования плотного слоя одиночных клеток, нормоцитов. Увеличение х4000 (об. х100, ок. х40). Покровное стекло по периметру покрывалось иммерсионным маслом для предотвращения высыхания образца. Опыт длился около десяти часов. Начался он как обычно, с фотографирования интерференционного поля образца для набора статистических данных по норме. Вскоре появилось такое ощущение, что наблюдается некая упорядоченная картина «поведения эритоцитов» которая и наблюдалась длительное время. Если суммировать наблюдение, возникает следующая картина: вокруг одного эритроцита образовалась розетка из клеток, кольцо. Около этого кольца был отмечен малый лимфоцит (по размерам и по наличию ядра) Из этого лимфоцита выделилось во внешнюю среду яркое образование, размером около 1 мкм и внедрилось в центральный эритроцит. Через несколько часов произошла трансформация эритроцита в малый лимфоцит, ядерную клетку шарообразной формы. Напомню время процесса, около десяти часов.

Будучи в трезвом уме и здравой памяти не поверил тому, что увидел, потому, что «так не может быть». Сейчас я считаю своим долгом описать этот процесс, так как я его понимаю: происходит деление ядра лимфоцита без образования двух клеток, одно ядро выделяется наружу (пиноцитоз) и внедряется в эритроцит, находящийся в центре розетки других клеток, ядро используя гемоглобин эритроцита, формирует все элементы ядерной клетки. Явление розеткообразования эритроцитов показано на сухих мазках.

В данном случае вероятно стимулирование лазерным светом данного процесса, так как, в литературе есть материалы о стимуляции гелий-неоновым лазером иммунных реакций in vivo.

Приложение 1.

«ЛЕОНАРДО ДА ВИНЧИ ХХ ВЕКА». Юбилейная сессия Российской академии естественных наук

В феврале 1997 года в стенах Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова прошла Юбилейная сессия Российской академии естественных наук в связи с десятилетием организации. Один день был посвящен 100 летнему юбилею А. Л. Чижевского. Пленарное заседание прошло в Главном Здании МГУ. Секционные заседания — в аудиториях геологического, географического и механико-математического факультетов.

По итогам сессии опубликованы ее материалы «ЛЕОНАРДО ДА ВИНЧИ ХХ ВЕКА». http://чижевский.рф/леонардо-да-винчи-хх-века-юбилейная-с/

Ниже публикуется текст, подготовленный для выступления, текст дополнен иллюстрациями и правками для облегчения понимания материала.1997-2022гг

ДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЖИВЫХ ЭРИТРОЦИТОВ

А.Н. Метелкин

Роль А.Л.Чижевского в постановке проблем изучения красной крови до конца не осмыслена и не все его идей реализованы и проверены. При работе с его книгами возникает ощущение колоссальной силы интеллекта, способного не только самостоятельно решать проблемы, но, что для нас самое главное, наводит внимательного читателя на новые оригинальные мысли и идей. Это “наведение идей”, вызванное прочтением его работ, сначала поражает своей силой, а потом требует от добросовестного и честного ученого развития этих идей, внутреннего спора с автором, а затем и конструирования цепочки исследований- доказательств истинности новых, свежих положений и фактов.

В семидесятых – восьмидесятых годах в Москве во ВНИИ оптико-физических измерений проводились медико-биологические исследования живых нефиксированных эритроцитов. Целью исследования являлась разработка методов диагностики и аппаратуры на основе методов лазерной техники и компьютерного анализа. Были выполнены научно-исследовательские работы в ходе которых проверялись возможности таких оптико-физических методов, как: голографическая микроинтерферометрия эритроцитов, лазерная нефелометрия, Фурье-микроскопия, лазерная телевизионная микроскопия. К этой работе были подключены ведущие институты страны кроме ВНИИОФИ в ней участвовали: Физический институт Академии Наук, Институт Атомной энергии им Курчатова, Московский институт электронного машиностроения, а со стороны медиков- 2-ой МОЛГМИ и ЦОЛИПК и другие институты.

Рис 1. Фазовая картина поверхности живого эритроцита с микропузырьками на поверхности. Картина получена в Институте Атомной энергии им Курчатова, в лаборатории Александра Петрова на основе обработки интерферограммы живой клетки.

Голографическая микроинтерферометрия эритроцитов. Преимущества.

Метод количественной диагностики эритроцитов на основе голографической микроинтерферометрии позволяет исследовать ЖИВЫЕ клетки крови БЕЗ ОБРАБОТКИ одновременно по многим параметрам (3) .Сравнительный анализ нового метода с традиционной световой и электронной микроскопией указал на дополнительные возможности микроинтерферометрии: количественная оценка поперечного сечения клетки, площади поверхности и объема эритроцита, сухого веса и концентрации гемоглобина.

При разработке голографического интерференционного микро­скопа выбор путей исследования определила книга А.Л.Чижевского (1)”Структурный анализ движущейся крови” в которой особое внимание обращается на изучение формы и профиля эритроцитов. Автор при минимальной аппаратурной базе смог максимально расширить представления о важности и научной ценности количественной оценки этой “простой” безъядерной клетки.

Живая клетка в физиологическом растворе при ее освещении проходящим и отраженным светом с точки зрения физической оптики является в основном фазовым объектом. Фазовое возмущение, вносимое клеткой в световую волну может быть количественно связано с геометрическими параметрами и концентрацией внутриклеточного содержимого на основе принципов интерферометрии.

Динамические характеристики живых эритроцитов.

Под динамическими характеристиками эритроцитов нами понимается: изменение формы профиля поперечного сечения клеток, их объема и площади поверхности, явление фрагментации мембраны с отщеплением микропузырьков и переход диск – сфера. Эти характеристики, динамические в том смысле, что являются ответными реакциями клетки на изменяющиеся условия внешней среды (плазмы и организма в целом ). Они могут протекать и очень быстро – за доли секунды при переходе от диска к сфере и очень медленно – возрастные изменения профиля сечения клетки.

Анализ ответных реакций живой клетки (динамических характеристик) в количественном виде может быть источником принципиально новой информации о состоянии организма человека и окружающей среды.

В данной работе было проведено изучение ответных реакций эритроцитов in vivo и in vitro на изменяющиеся условия внешней среды (плазмы крови и организма в целом). Были проанализированы следующие процессы в количественном виде: изменение формы профиля поперечного сечения клеток, их объема и площади поверхности, явление фрагментации мембраны с отщеплением микропузырьков и переход от дискоидальной формы клетки к сфере.

В обследованных группах больных с обменными патологиями (диффузный гломерулонефрит и сахарный диабет) и с нарушением цитомембраны (наследственный сфероцитоз) выявлено, как достоверное различие средних показателей, так и единообразие характера возрастных изменений в норме и при патологии. Это указывает на наличие единого механизма изменения формы дискоцитов для нормы и патологии вне зависимости от природы воздействующего фактора.

Сравнительный анализ литературных данных и полученных результатов показал, что в основе изменений эритроцитов в организме: их формы и размеров, их массы и концентрации гемоглобина лежит процесс фрагментации поверхности эритроцитов с отщеплением микро-пузырьков, содержащих гемоглобин в меньшей концентрации, чем в эритроците. Расчеты показывают, что в процессе жизнедеятельности у эритроцита происходит от 20 до 30 отщеплений микропузырьков и при этом для клетки значительно облегчается переход от диска к сфере.

Таким образом эритроцит имеет две взаимосвязанные и разнесенные во времени реакции локальную (фрагментация мембраны) и интегральную (переход от диска к сфере). Фрагментирование мембраны с ее отщеплением в виде микропузырьков для эритроцитов является физиологической приспособительной реакцией в ответ на локальное, внешнее или внутренне воздействие в конкретной точке мембраны. Известно, что актомиозиноподобный сократительный белок – спектрин, выстилающий внутреннюю поверхность мембраны эритроцита имеет контакты с основными ферментными системами клетки, с иммунными молекулами и с гемоглобином. Локальное нарушение целостности мембраны (ее барьерной функции) губительно для клетки и может быть устранено путем отделения части поверхности путем отшнуровывания в виде микропузырьков с поврежденным участком.

Переход от диска к сфере является общим интегральным ответом клетки на значительные изменения и может проходить скачком, иметь, как обратимый, так и необратимый характер. При этом площадь поверхности клетки резко уменьшается за счет образования микропузырьков и, если они отрываются, то эритроцит необратимо принимает форму сферы. Объем клетки мало изменяется, что говорит не о простом набухании клетки, а о ее “схлопывании” в сферу без увеличения объема.

Сравнение полученных результатов с литературными данными по физиологии эритроцитов указывает на то, что переход диск-сфера может выступать как единый механизм удержания ослабленных (наследственный сфероцитоз) или старых эритроцитов в селезенке с последующей их утилизацией. Вне зависимости от вида патологии эритроциты удерживаются внутри селезенки при их сферуляции из-за наличия в этом органе повреждающих факторов. Молодые и взрослые эритроциты проходят через этот фильтр без сферуляции из-за большей устойчивости к повреждающим факторам. Таким образом, реакция эритроцитов – переход от диска к сфере при наличии повреждающих факторов различной природы (иммунных, физико-химических и других) может служить простым и надежным маркером для отбора и утилизации слабых клеток например в селезенке.

Может быть выстроена определенная цепь событий, определяющая развитие и утилизацию эритроцита: молодой эритроцит – потеря микропузырьков в сосудистом русле и селезенке, как приспособительная реакция клетки на повреждения, зрелый эритроцит – изменение профиля клетки ее утолщение и повышение концентрации гемоглобина, и как следствие общего старения и изменения профиля на менее гибкий – облегченный переход от диска к сфере – сферуляции в селезенке и задержка старого или больного эритроцита и его утилизация.

Развитие идей А.Л.Чижевского о важности изучения формы живых эритроцитов, как главной приспособительной характеристики динамично изменяющейся клетки привело нас к вышеописанным обобщениям, ко­торые могут иметь свое развитие в различных фундаментальных и прикладных областях медицины и экологии. исследования этой интереснейшей по информативности клетки крови.

Мы глубоко убеждены, что живой эритроцит – эта чисто обменная, безъядерная клетка может служить хорошим тест-объектом для диагностики на двух уровнях: во-первых при изучении патогенеза различных заболеваний и для контроля терапии и, во-вторых при биотестировании на клеточном уровне бологически-активных сред, полей и излучений.

1. А.Л.Чижевский. Структурный анализ движущейся крови. М. 1959

2. А.Л.Чижевский. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов.

Новосибирск. Наука. 1980 177с

3. А.Н.Метелкин, В.Н.Манин, А.Г.Румянцев. Анализ формы и размеров эритроцитов при наследственном микросфероцитозе и у здоровых детей методом голографическоймикроинтерферометрии. -“Педиатрия”, 1980, 5, с. 43-45.

4. Б.М.Степанов, Ю.Е.Вельтищев, А.Н.Метелкин, Ю.Е.Князев, В.Н.Манин, А.Г.Румянцев. Возможности использования оптической голографии в клинических исследованиях. «Советская медицина”, т.5, 1983

Summary: The paper demonstrates that holography methods can be used in cy-

tomorphological reseach for quantitative assessment of non-fixed living red cells.

These methods widen the possilities of optic mikroscopy, permitting the physi-

cians to make their studies more objective with the help of more precise quan-

titative criteria to evaluate the state of cells.

Метелкин Александр Николаевич – кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник по специальности «биофизика». Область исследований: разработка аппаратуры и методик для медико-биологических методик диагностики живых клеток крови на основе лазерной и вычислительной техники.

Место работы: с 1971 по 1986г – ВНИИ оптико-физических измерений,

с 1986 по 1990 – заведующий проблемной гематологической лабораторией КБ 6, 3ГУ,

с 1990 по 1997 – директор ООО “Медицинский центр ЭРИТРОН”

с 1992 по 1995 – старший преподаватель кафедры биофизики Московской Ветеринарной Академии.